Identifikasi e coli Dengan Metode MPN

Identifikasi e coli Dengan Metode MPN
Identifikasie coli didahului dengan pengenceran sampel yang akan
dianalisis. Pengenceran dilakukan dengan cara mencampurkan sampel
dengan berat atau volume tertentu pada larutan pengencer yang telah
disterilkan. Larutan pengencer yang biasa digunakan antara lain:
 Pengencer umum : 0,1% pepton + 0,85% natrium klorida (NaCl)
 Pengencer untuk mikroba anaerobic
 Pengencer yang digunakan untuk pertumbuhan mikroba anaerob harus
mampu menjaga potensial oksidasi reduksipengencer tetap rendah.
Mikroba anaerob sangat rentan terhadap oksigen, sehingga perlu
penggunaan teknik khusus seperti aplikasi teknik Hungate atau
penggunaan ruang anaerobic.
 Pengencer untuk mikroba osmofilik dan halofilik
 Pengencer yang digunakan untuk mikroba osmofilik adalah larutan
pengencer yang mengandung 20% larutan sukrosa steril.
 Pengencer yang digunakan untuk mikroba halofilik adalah larutan
pengencer yang mengandung 15% natrium klorida (NaCl) steril.
Selanjutnya pengenceran akan lebih mudah dihitung jika dilakukan secara
desimal 1:10 (b/v atau v/v), misalnya 10 ml sampel dimasukkan ke dalam
90 ml atau 25 gr sampel dimasukkan ke dalam 225 ml larutan pengencer
sehingga diperoleh pengenceran 10-1. Selanjutnya, diambil sebanyak 10 ml
dari pengenceran pertama dan dimasukkan kedalam 90 ml pengeceran
kedua sehingga diperoleh pengenceran 10-2.Kemudian diulang terus
sampai pada pengenceran yang kita harapkan.

Pada prinsipnya, ada beberapa tahapan dalam indentifikasi e coli dengan
menggunakan metode MPN, antara lain: Uji penduga atau uji presumtif, uji
penegas atau uji konfirmasi, dan uji pelengkap. Pengujian MPN Coliform
dan Escherichia coli menggunakan media Lactose broth (LB) dan tabung
Durham. LB merupakan media perbenihan selektif yang mengandung
laktosa. Tabung durham digunakan untuk mengetahui adanya
pembentukan gas oleh bakteri yang terdapat dalam sampel tersebut.
Terbentuknya gas dan asam menandakan adanya Escherichia coli dan
bakteri Coliform.Jika pada suatu uji hanya terbentuk gas menandakan
adanya Coliform tanpa ada Escherichia coli.Terbentuknya asam ditandai
dengan perubahan warna biakan menjadi kuning.Tabung yang belum
menunjukkan reaksi positif, diinkubasi lagi selama 24 jam.Jika setelah masa
inkubasi kedua ini ditemukan gas, maka dilanjutkan uji selanjutnya.Namun
apabila tetap tidak terbentuk gas, maka hasilnya dianggap negatif dan tidak
perlu dilakukan uji lanjutan.Uji positif juga ditunjukkan dengan terjadinya
perubahan warna medium yaitu dari merah menjadi kuning atau
oranye.Tahap ini merupakan uji presumtif.
Sampel yang menunjukkan uji penduga positif dilanjutkan ke uji
penegasan. Uji penegasan atau uji konfirmasiColiform menggunakan media
Brilliant Green Lactose Bile broth (BGLBB) yang didalamnya dilengkapi
dengan tabung durham. Kemudian diinkubasi 24 jam pada suhu 370C. Uji
ini dinyatakan positif jika terbentuk gas dalam tabung durham.
Sampel yang menunjukkan uji penegasan positif dilanjutkan ke uji
pelengkap.Biakan dalam tabung yang positif digorekan ke media Eosin
Methylen BlueAgar (EMBA) yang merupakan media diferensial untuk
Escherichia coli.Kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu 370C.
Koloni spesifik tumbuh dengan ciri-ciri bentuk bulat, diameter 2-3 mm,
warna hijau dengan kilap logam dan bintik biru kehijauan di tengahnya.
Koloni tersebut selanjutnya diuji pewarnaan Gram, diinokulasikan ke
media NA (Nutrient Agar) miring. Biakan yang diinokulasikan ke dalam
media NA selanjutnya diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam. Kemudian
diamati perubahan warna dan gas yang terbentuk pada tabung berisi media
dan biakan. Secara keseluruhan, uji coliform dapat digambarkan seperti
dibawah ini
Setelah melakukan identifikasi bakteri tersebut, selanjutnya kita dapat
melakukan perhitungan jumlah bekteri dengan metode Most Probable
Number (MPN)